細胞培養(yǎng)物被支原體污染是極普遍的問題，面對支原體污染給細胞培養(yǎng)帶來的巨大難題，世界各國開始重視，并相繼建立了細胞庫，對細胞質(zhì)量進展控制，效guo顯著，支原體污染的問題得以限制。目前已知能污染細胞的支原體有20多種以上，其中95％以上的支原體污染是口腔支原體。

支原體的污染來源

（1）細胞之間交叉污染；

（2）細胞培養(yǎng)操作人員的口腔、皮膚等；

（3）工作環(huán)境或?qū)嶒炂鞑牡奈廴荆?/p>

（4）培養(yǎng)基的污染。

支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。細胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個方面來預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴格實驗操作；細胞培養(yǎng)和器材要保證無菌；在細胞培養(yǎng)中加入適量的抗生素。

1、支原體檢測

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標記，使PCR擴增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進行DNA擴增反應(yīng)的實時監(jiān)測，簡稱qPCR。

優(yōu)點：①靈敏度高、特異性強。

②時間短，2-3小時出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點：①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補充驗證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計不同），需謹慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導下使用。

德國MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測試劑盒（均為探針法檢測），依據(jù)操作步驟的細微差別，

分『經(jīng)典法』和『一步法』兩種。

2、環(huán)境空間消毒方案

試驗臺、超凈臺、培養(yǎng)箱、液氮罐、移液器、門把手、電話等細胞培養(yǎng)環(huán)境

被支原體污染，可引起細胞的污染。應(yīng)定期對工作區(qū)域進行消毒。

德國MB生產(chǎn)的Mycoplasma-offTM噴霧劑，或濕巾擦拭 5-10分鐘清除，對支原體、細菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無殘留, 無腐蝕, 無致癌性，操作簡單方便。

qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標記，使PCR擴增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進行DNA擴增反應(yīng)的實時監(jiān)測，簡稱qPCR。

優(yōu)點：①靈敏度高、特異性強。

②時間短，2-3小時出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點：①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補充驗證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計不同），需謹慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導下使用。